1.被灭菌物体含菌量
含菌量越高，需要的灭菌时间越长。因此，用天然原料配制的培养基所需的灭菌时间要比组合培养基所需的长。
天然原料简单来说，营养成分既复杂又丰富、难以说出其确切化学组成的原料就是天然原料，比如说各种蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆等。
培养基中含有这些成分需要较长的灭菌时间，尤其是玉米浆等。
2.灭菌锅内空气排除程度
灭菌锅是靠蒸汽的温度而不是单纯靠压力来达到灭菌效果的。混有空气的蒸汽与纯蒸汽相比，其压力与温度的关系很不相同，因此，使用加压蒸汽灭菌时，必须先彻底排尽锅内的空气。
(1)灭菌锅上同时装有压力表和温度计；
(2)将待测气体引入深层冷水中，若只听到“扑扑”声而无气泡冒出，则证明蒸汽中已不含空气；
(3)灭菌锅内加入耐热性的芽孢杆菌，灭菌后取出培养，观察其是否能生长即可知灭菌温度是否达到；
(4)加入适当熔点的固体试剂，经灭菌后看其是否熔化等等。
3.灭菌对象的ph
灭菌对象的ph<6.0时，微生物易死亡；ph在6.0~8.0时，微生物不易死亡。
4.灭菌对象的体积
灭菌对象的体积大小因影响热传导速率和热容量，故会明显影响灭菌效果。在实验室工作中，在对大容量培养基灭菌时，必须注意相应延长灭菌时间。
这一点要提醒一下，很多朋友在灭培养基的时候往往只注意到培养基的成分而忽略培养基的体积，10ml培养基和5-6l灭菌时间一致，结果只有一个，要么没灭透要么灭过了。
5.加热与散热速度
在加压灭菌时，一般只注意达到预定压力后的维持时间。事实上，由于季节的变化，或灭菌物件体积的大小，都会使“上磅”或“下磅”时间出现很大的差别，从而影响培养基成分的破坏程度，进一步影响研究工作的准确性和重复性，故应适当控制。
