二、原理
三、双层平板法的应用1-噬菌体的分离培养
1.试验详细操作步骤
(1)配制底层培养基和上层培养基
底层培养基琼脂粉含量：1.5%-2%。
底层培养基培养基：无菌水加1.5%-2%琼脂粉，灭菌，待冷却至50℃倒平板，凝固后备用。
上层培养基琼脂粉含量：1%。
(2)倾倒上层培养基
一般情况，待测样品为噬菌体污染的样品。
①取培养基：取出上层培养基，冷却至45℃左右。
②取样品：用移液器取样品0.5ml放入上层培养基中。
③取试验菌：接着用移液器吸取大肠杆菌菌液0.2ml，也放入上层培养基中，沿壁摇匀。
④倾倒平板：将上述混合液快速倒入底层培养基上面，凝固。
(3)培养
上层培养基凝固后，放置于恒温培养箱中倒置培养。
2.操作技巧：
(1)底层培养基不宜太厚，覆盖培养皿底部即可。
太厚上层培养基无法倒入，太薄不能覆盖培养皿底部，起不到应有的作用。
(2)上层培养基灭菌完成后，要摇匀放入水浴锅中，间隔沿壁摇动。
经常摇动，培养基不容易出现结块。
(3)水浴锅温度调至60℃，温度不宜太高或太低。
温度太高，想用的时候冷却较慢；温度太低，凝固的又太快。
(4)上层培养基温度降至45℃左右，再加入污染菌液和试验菌。
这个温度既能保证培养基和菌液混匀，又能保证不凝固不结块。
(5)上层培养基要沿壁摇匀，尽量避免产生气泡。
气泡太多，噬菌斑锯齿状，很难看。
(6)控制好试验菌浓度。一般正好覆盖一层菌液为好。
3.注意事项：
(1)酒精灯旁边操作，时刻保持无菌意识。
(2)双层平板法相对厚度不易把握，一定要看准，不能溢出或太厚。
