本标准规定了食品中大肠菌群(coliforms)计数的方法。
本标准第一法适用于大肠菌群含量较低的食品中大肠菌群的计数;第二法适用于大肠菌群含量较 高的食品中大肠菌群的计数。
二、术语和定义
1 大肠菌群 coliforms
在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2 最可能数 mostprobablenumber
mpn 基于泊松分布的一种间接计数方法。
三、检验原理
1、mpn法
mpn 法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后,根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度,应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。
2、平板计数法
大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸,在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色,带有或不带有沉淀环的菌落。
四、设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
.恒温培养箱:36 ℃ ±1 ℃
.冰箱:2 ℃~5 ℃
.恒温水浴箱:46℃±1℃
.天平:感量 0.1g
.均质器
.振荡器
.无菌吸管:1ml(具 0.01ml 刻度)、10ml(具 0.1ml 刻度)或微量移液器及吸头
.无菌锥形瓶:容量500ml
.无菌培养皿:直径 90mm
.ph 计或 ph 比色管或精密ph 试纸
.菌落计数器
五、培养基和试剂
.月桂基硫酸盐胰蛋白胨(laurylsulfatetryptose,lst)肉汤
.煌绿乳糖胆盐(brilliantgreenlactosebile,bglb)肉汤
.结晶紫中性红胆盐琼脂(violetredbileagar,vrba)
.无菌磷酸盐缓冲液
.无菌生理盐水
.1mol/lnaoh 溶液
第一法：大肠菌群 mpn计数法
一、检验程序
二、操作步骤
1、样品的稀释
①固体和半固体样品:称取25g样品,放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内 ,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1∶10的样品匀液。
②液体样品:以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶 (瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)或其他无菌容器中充分振摇或置于机械振荡器中振摇,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。
③样品匀液的ph 应在6.5~7.5之间,必要时分别用1mol/lnaoh 或1mol/l hcl调节。
④用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1ml,沿管壁缓缓注入9ml磷酸盐缓冲 液或生理盐水的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1ml无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
⑤根据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
2、初发酵试验
每个样品,选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液体样品可以选择原液),每个稀释度接种3管 月桂基硫酸盐胰蛋白胨(lst)肉汤,每管接种1ml(如接种量超过1ml,则用双料lst肉汤),36 ℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验(证实试验),如未产气则继续培养至48h±2h,产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。
3、复发酵试验(证实试验)
用接种环从产气的lst肉汤管中分别取培养物1 环,移种于煌绿乳糖胆盐肉汤(bglb)管中，36 ℃±1 ℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。
4、可能数(mpn)的报告
根据确证的大肠菌群bglb阳性管数,检索 mpn 表,报告每g(ml)样品中大肠菌群的 mpn 值。
现行有效的16版&03版
第二法：平板计数法
一、检验程序：
1、样品的稀释
按mpn法中的稀释方法进行
2、平板计数
①选取2个~3个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1ml。同时取1ml 生理盐水加入无菌平皿作空白对照。
②及时将15ml~20ml融化并恒温至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(vrba)约倾注于每个平 皿中。小心旋转平皿,将培养基与样液充分混匀,待琼脂凝固后,再加3ml~4mlvrba 覆盖平板表 层。翻转平板,置于36 ℃±1 ℃培养18h~24h。
3、平板菌落数的选择
选取菌落数在15cfu~150cfu 之间的平板,分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落 (如菌落直径较典型菌落小)。典型菌落为紫红色,菌落周围有红色的胆盐沉淀环,菌落直径为0.5mm 或更大,最低稀释度平板低于15cfu 的记录具体菌落数。
4、证实试验
从 vrba 平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落,少于10个菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分别移种于 bglb肉汤管内,36℃±1℃培养24h~48h,观察产气情况。凡bglb肉汤管产气, 即可报告为大肠菌群阳性
5、大肠菌群平板计数的报告
经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每 g(ml)样品中大肠菌群数。例:10-4样品稀释液1ml,在 vrba平板上有100个典型和可疑菌落,挑取其中10个接种bglb肉汤管,证实有6个阳性管,则该样品的大肠菌群数为:
100×6/10×104/g(ml)=6.0×105cfu/g(ml)。若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀 释倍数计算。
备注:
6.0×105cfu/g(ml)也 就是600000cfu/g(ml)这个作为公司统一的数据修约后的报告方式，若均无菌落生长则报告值为<10cfu/g(ml)
例: 10-2样品稀释液1ml，在vrba平板上有90个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种bglb肉汤管，证实有10个阳性管,则该样品的大肠菌群数为: 90×10/10×102/g(ml)=9000cfu/g(ml)
