1.引物
引物是pcr特异性反应的关键，pcr产物的特异性取决于引物与模板dna互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板dna序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用pcr就可将模板dna在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：g c含量以40-60%为宜，g c太少扩增效果不佳，g c过多易出现非特异条带。atgc最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致pcr失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为宜。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
2.酶及其浓度
目前有两种taq dna聚合酶，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的pcr反应约需酶量2.5u(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
3.dntp的质量与浓度
dntp的质量与浓度和pcr扩增效率有密切关系，dntp粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dntp溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1m naoh或1m tris-hcl缓冲液将其ph值调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dntp降解。
在pcr反应中，dntp应为50～200umol/l，尤其是注意4种dntp的浓度要相等(等摩尔配制)。当其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低pcr产物的产量。dntp能与mg2 结合，使游离的mg2 浓度降低。
4.模板(靶基因)核酸
模板核酸的量与纯化程度是pcr成败与否的关键环节之一。传统的dna纯化方法通常采用sds和蛋白酶k来消化处理样本。sds的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，sds还能与蛋白质结合而沉淀；
蛋白酶k能水解消化蛋白质，特别是与dna结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于pcr反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于pcr扩增。rna模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶k法，要防止rnase降解rna。
5.mg2 浓度
mg2 对pcr扩增的特异性和产量有显著的影响。在一般的pcr反应中，各种dntp浓度为200umol/l时，mg2 浓度为1.5～2.0mmol/l为宜。mg2 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增；浓度过低会降低taq dna聚合酶的活性，使反应产物减少。
